玻片在覆蓋蓋玻片后晾干，并在顯微鏡上使用適合每個熒光團的濾鏡來顯示熒光。你可以用多個濾鏡獲取同一微觀區(qū)域的圖像，然后將圖像合并為多色效果。如果你的組織是厚的，可以用一個共聚焦熒光顯微鏡來獲得更清晰的圖像，可以在三維空間中對抗原定位進行旋轉(zhuǎn)。
對于大多數(shù)熒光IHC實驗，簡單的PBS溶液可以在抗體孵育過程中很好地進行沖洗。在某些情況下，可以添加0.05%的Tween-20來幫助減少背景，但通常是不必要的。
二抗可以偶聯(lián)不同的熒光團，有不同的顏色，綠色紅色或藍色。選擇二抗，考慮與一抗的特異性以及需要的熒光顏色。可以一個切片使用多種顏色，通過偶聯(lián)幾個有差異的熒光團的二抗來實現(xiàn)，這些二抗根據(jù)宿主來源來區(qū)分一抗。像一抗一樣，將二抗組合成一個孵育溶液。二抗在室溫下避光孵育45分鐘，以避免熒光團褪色。
熒光核復染劑有助于識別樣品中不表達你的興趣抗原的細胞。一個好的復染劑也可以在你的組織樣本內(nèi)提供一些背景和結(jié)構(gòu)線索。如果你沒有使用藍色通道作為你的一抗之一，你可以在1μg/mL DAPI中孵育你的樣本，標記細胞核，持續(xù)5分鐘。還可以購買含DAPI的封片劑，以節(jié)省額外的步驟
微波加熱模型如下：加熱空玻片直到緩沖液開始沸騰。例如，調(diào)整微波爐的功率設置為30%。加熱10分鐘，觀察。應避免劇烈煮沸。如果達到快速煮沸，移開玻片，用新鮮的室溫緩沖液重復優(yōu)化。把功率降低到20%，而不是30%。一旦加熱程序被優(yōu)化，記錄下來，以同樣的方式執(zhí)行。
為了染細胞核或細胞質(zhì)抗原，經(jīng)常需要透化作用。一旦你的組織切片已經(jīng)冷卻，將其置于稀釋的去垢劑溶液中，如Tween-20或Triton x - 100，大約5分鐘，進行透化處理。這種方式會破壞組織的細胞膜，增加細胞通透性，允許抗體達到細胞內(nèi)的目標。用PBS沖洗玻片。
然后，與正常血清孵育進行封閉，10-15分鐘，防止一抗和二抗的非特異性結(jié)合。
封閉血清中的抗體和其他蛋白 非特異性結(jié)合到組織切片上，有效地阻斷在以后的步驟中一抗和二抗的非特異性結(jié)合。封閉血清可與二抗相同種屬或者不相關(guān)種屬。任何封閉溶液不能含有與一抗同種屬的血清，以避免熒光二抗與之結(jié)合產(chǎn)生非特異性熒光。
選擇一抗，基于它與目的抗原的特異性，以及對IHC或免疫細胞化學的適用性。
為WB或ELISA設計的抗體可能無法識別在固定組織中交聯(lián)的目標抗原。針對多個目標的一抗可合并為一種孵育液，前提是它們有不同的宿主來源，因此可以用不同的二抗來檢測它們。
一抗稀釋于PBS或PBS-Tween,與樣本孵育于室溫下一小時或4oC過夜。對于每個實驗，應該包括一個組織切片對照，與一種非特異性同型對照抗體結(jié)合，該抗體與一抗的類型相匹配(如果一抗是單克隆抗體)，但不識別目標抗原表位。同型對照有助于區(qū)分非特異性的背景熒光，從特定的熒光標記的目標抗原。如果一抗是多克隆抗體，包括一種與非特異性的、種屬匹配的多克隆抗體孵育的組織切片。
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將蓋玻片蓋到玻片上，使用適用于熒光顯微鏡的封片劑來幫助保存樣品中的熒光信號。使用足夠的封片劑封住蓋玻片，注意消除氣泡，以免圖像變形或模糊。
玻片在覆蓋蓋玻片后晾干，并在顯微鏡上使用適合每個熒光團的濾鏡來顯示熒光。你可以用多個濾鏡獲取同一微觀區(qū)域的圖像，然后將圖像合并為多色效果。如果你的組織是厚的，可以用一個共聚焦熒光顯微鏡來獲得更清晰的圖像，可以在三維空間中對抗原定位進行旋轉(zhuǎn)。
